基于紫外可见分光光度法检测烟碱公式的探讨（一）

烟碱作为烟叶的基于碱特征成分不仅具有调节吸食者情绪的作用，而且是紫外广谱杀菌剂和杀虫剂。随着检测技术的分光法检进步，烟碱的光度检测方法已从最初的硅钨酸重量法，发展到后来的测烟紫外分光光度法、连续流动分析法、探讨气相色谱法(GC、基于碱GC-MS)、紫外液相色谱法(HPLC)等。分光法检每种方法都有其适合的光度应用场景、需求和价值，测烟也各具优缺点，探讨如连续流动分析法、基于碱GC-MS、紫外HPLC法检测精确度高，分光法检但是仪器较为昂贵；硅钨酸重量法设备简单但操作繁琐、步骤多且精确度较低。而紫外分光光度法操作较为简单，设备便宜，精确度较高，广泛应用于教学和实践中。

1977年原轻工业部烟草所推荐了用紫外分光光度法测烟碱。1982年王秀芝等在此基础上补充了待测液的最适浓度、萃取时间等，并且修订了检测烟碱的计算公式；同年，孙瑞申等又进行了细化和完善。前辈们得出的最重要的结论是验证和完善了烟碱含量计算公式，即

细读前辈们的研究结果，发现使用该公式的前提和相关注意事项有：1) 原公式是以硅钨酸重量法检测结果为标准制定，1.059是与该方法对比后的校正系数；2) 处理方法为蒸馏法，即把样品、水、氯化钠、氢氧化钠一起放入烧瓶中加热蒸馏，馏分经硫酸吸收后进行检测；3) 溶液吸光度在0.167～0.651，其对应烟碱浓度为5～18 mg/L；4) 原公式的提出是基于假设杂质对烟碱在259 nm处吸光度的干扰等于236 nm和282 nm处干扰形成梯形的中位线。

在教学和实践应用中，该公式应用较广，但也存在一些瑕疵：1) 原公式的样品处理方法为蒸馏法，而该方法操作繁琐，因此在一些实际应用时很容易被忽视而采用溶剂萃取法，不同的处理方法其杂质差异较大，原公式在此适用性存疑；2) 校正系数1.059以硅钨酸重量法为基准，现今可采用更精确的高效液相色谱法；3) 原公式以烤烟为原料，对其它类型烟叶的适用性未知。因此，该研究以高效液相色谱法检测结果为基准，采用更常用的溶剂萃取法进行前处理，分别以4种不同类型烟叶即烤烟、白肋烟、雪茄烟、晒烟为对象尝试对该公式进行完善，以便为应用者提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

烤烟(54个，产地云南、河南、江西、贵州、重庆)、晒红烟(4个，产地吉林)、白肋烟(4个，产地湖北)和雪茄烟(15个，产地海南、四川)，共计77个。

烟碱(加拿大，TRC)；醋酸钠、磷酸、三乙胺、盐酸、氢氧化钠、乙醇(分析纯，天津大茂)；乙腈、甲醇(色谱纯，天津科密欧)。

电子天平(上海上平，精度0.000 1 g)，超声仪(郑州生元，SYU-10-300 DT)，pH计(上海丰控，FK-PH10)，液相色谱(日本岛津，LC-20 A)，紫外可见分光光度计(上海元析，UV-5200)。

1.2 样品紫外扫描

用紫外分光光度计对烟碱(乙腈溶解)、乙醇、甲醇、烟样(5%甲醇萃取)在210 ～360 nm进行扫描。

配制不同浓度烟碱溶液，在259 nm处考察吸光度线性范围。

1.3 萃取溶剂对烟碱的影响

称取100 mg粉碎后过40目筛的烟叶样品(以下简称样品)，放入锥形瓶中，分别加入不同浓度的盐酸、氢氧化钠、氨水、甲醇的水溶液20 mL，震荡萃取30 min， 用磷酸或三乙胺溶液调节pH值至5左右(甲醇萃取液无须调节pH值)，过滤至50 mL容量瓶中，定容，用于HPLC检测。

1.4 萃取时间对烟碱的影响

称取100 mg样品，放入锥形瓶中，加入5%甲醇水溶液20 mL，分别萃取10、15、20、25和30 min， 过滤至50 mL容量瓶中，定容，用于HPLC检测。

1.5 紫外分光光度法检测

称取100 mg样品，加20 mL 5%甲醇萃取30 min， 过滤至50 mL容量瓶定容后得到样品溶液。样品溶液分成2份，1份用于液相色谱检测，1份稀释20倍后以水为对照用分光光度计进行检测，检测波长分别为236、240、260、282 nm。

1.6 液相色谱法检测

配制不同浓度烟碱标品溶液，用于绘制标准曲线。

色谱条件：岛津Shim pack GIST C18(250 mm×4.6 mm， 5 μm)，流动相A(90%甲醇+10%水，0.1%醋酸钠，pH值6.8)，流动相B(90%水+10%甲醇，10 ppm磷酸，pH值3.8)，流动相B占4.5%，流速1.0 mL/min， 柱温35 ℃，进样量20 μL。

1.7 数据处理

用外标法进行定性和定量检测，数据用Excel 2016和SPSS 19.0进行分析，用origin 8.0作图。

2 结果与分析

2.1 样品的紫外扫描

由图1可知，烟碱最强吸收峰在259 nm处，谷底在236 nm处，大于282 nm后无吸收。而乙醇在小于268 nm时具有紫外吸收，因此，不能用含乙醇溶剂进行萃取后用紫外分光光度计检测烟碱含量。甲醇在大于240 nm时几乎无紫外吸收，因此，可以用作萃取溶剂。对5%甲醇水溶液作为萃取剂得到的4种类型烟叶的萃取液进行扫描后发现，各萃取液均在259 nm处有最强吸收。并且这4种样品溶液的谷底均在240～242 nm， 大于烟碱的谷底所处波长236 nm。雪茄烟、白肋烟和晒红烟样品溶液的吸收曲线走势较为一致，在大于276 nm后雪茄烟、白肋烟和晒红烟溶液的吸光度均呈现缓慢下降走势，而烤烟溶液吸光度在276～328 nm内下降趋势不明显。

由表1可以看出，紫外吸收峰谷比值差异非常大，烟碱达到3.27，烤烟最小，为1.02，而3种晾晒烟比值较为接近，为1.22～1.27。

由图2a、b可知，在烟碱浓度小于0.909 μg/mL(吸光度为0.047)和浓度大于128.424 μg/mL(吸光度2.088)，曲线有偏离趋势。在中浓度范围2.056(吸光度0.074)～116.080 μg/mL(吸光度1.935)其线性关系较好，R2为0.999 2，远远好于前人研究结果中的线性范围0.167～0.671和0.2～0.8，线性范围的大幅扩展说明现今的紫外分光光度计性能有大幅提升。

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